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1,2-二氯乙烷亚急性暴露对大鼠抑郁样行为 及单胺神经递质水平的影响
点击次数:113 发布时间:2019-07-29

目的探讨1,2-二氯乙烷1,2-DCE)亚急性暴露对大鼠抑郁样行为的影响及其可能单胺神经递质的作用 机制方法无特定病原体级雄性SD大鼠随机分为对照组和低高剂量组每组10,分别予02040

80 mg/kg体质量1,2-DCE(以玉米油稀释)灌胃染毒21连续染毒14。染毒结束后,采用旷场实验

糖水偏爱实验和强迫游泳实验观察大鼠行为学变化情况,采用高效液相色谱-电化学检测法测定大鼠大脑前额皮 层、海马、纹状体中单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)去甲肾上腺素(NA)和多巴胺水平。结果与对照组比较,

高剂量组大鼠直立次数中心区域活动时间和路程均减少P <0.05),糖水偏爱度下降P <0. 05),强迫游泳实 验中不动时间延长P<0. 05)大鼠前额皮层海马纹状体内5-HTNA和多巴胺水平均随着1,2-DCE染毒剂量 的增加而下降P <0.05),呈剂量-效应关系。高剂量组大鼠前额皮层海马纹状体内5-HTNA和多巴胺水平均 低于对照组P<0. 05)。结论1,2-DCE亚急性暴露可诱导大鼠抑郁样行为,其机制可能与降低前额皮层海马

纹状体内单胺类神经递质的水平相关

关键词:1,2-二氯乙烷;抑郁症;单胺类神经递质;5-羟色胺;去甲肾上腺素;多巴胺;行为学;大鼠

 

  • 二氯乙院(1,2~dichloroethane, 1,2-DCE)是工 业上用途广泛的有机溶剂,其属高毒类神经性毒物; 在职业活动过程中短时间大量接触1,24)CE可导致 职业性急性或亚急性1,2-)CE中毒,其主要靶器官是 中枢神经系统。行为功能改变是神经系统内在受 损的外部表现,神经损伤引起的行为学的改变可作为 反映神经毒性的评价指标。在中枢神经系统中,神经 递质对突触信息的传递起到兴奋性或抑制性的作用, 主要包括单胺类递质、氨基酸类递质、胆碱类递质和 神经肽等[4_5]。中枢神经系统内单胺神经递质如5-羟 色胺(54iydroxytryptamine, 5-HT)、去甲肾上腺素 (norepinephrine, NA)和多巴胺的异常代谢可干扰神经 突触内信息传递,进而使睡眠、情绪调控和学习记忆 等神经活动受到影响。本研究通过观察1,2-)CE 亚急性暴露对大鼠抑郁样行为的影响,并观察大鼠大 脑前额皮层海马纹状体内5~HTNA和多巴胺水平 变化情况,为探讨1,24)CE的中枢神经系统毒作用机 制提供参考。

1材料和方法

1.1动物无特定病原体级雄性SD大鼠广东省实 验动物中心,实验动物生产许可证号:SCXK(粵)2013- 00002] 40只,体质量180 ~220 g大鼠饲养于广东省 职业病防治院实验动物屏障设施(无特定病原体级动 物房)内实验动物使用许可证号:SYXK (粵)2014- 0048],自由进食和饮水。本研究经广东省职业病防 治院实验动物伦理委员会批准。

1。2仪器和试剂旷场实验装置SuperMaze旷场试 验视频分析系统(XR-XZ301,上海欣软信息科技河北11选5);强迫 游泳实验装置为带有高度标记的透明圆柱形游泳 ,上海欣软信息科技河北11选5);0. 22 pm滤膜(上 海安谱实验科技河北11选5;Agilent RX~C18色谱柱 (250。 0 mm X 3.0 mm X5. 0 pm)Agilent 1260 高效液 相色谱系统(美国Agilent公司);CoulochemM电化学 检测器(美国ESA公司Millipore超纯水机(美国 Millipore 公司。1,2~DCE (分析纯,纯度彡99。 50%, 广州化学试剂厂);玉米油(益海嘉里食品营销有限公 司);异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技河北11选5);高氯 酸(优级纯NA、-辛烷磺酸钠磷酸氢二钠乙二胺 四乙酸二钠三乙胺(均为色谱纯度5~HT多巴胺(均 为分析纯,上海阿拉丁生化科技股份河北11选5);乙腈 (色谱纯,美国赛默飞世尔科技公司蛋白沉淀液为 含浓度为0。100 mmol/L的高氯酸和体积分数为 0。 01%乙二胺四乙酸二钠的水溶液。磷酸二氢钠缓冲 溶液为含浓度分别为1。 700、25. 000、0。 025、0。 700 mmol/L1-辛烷磺酸钠、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸 二钠和三乙胺的水溶液,pH值为3。 0)。

1。3动物分组与染毒大鼠经检疫并适应性饲养 1周后,采用随机数表法分为对照组和低、中、高剂量 组,每组10只。本研究预实验结果显示,雄性SD大 鼠半数致死量为681 mg/kg体质量。参照本课题组前 期研究8 ,本研究设计1,2~DCE染毒剂量在低高 剂量组分别为20、40和80 mg/kg体质量。实验时,低、 中高剂量组大鼠分别予质量浓度为204080 g/L1,2~DCE溶液(以玉米油配制)灌胃灌胃体积为 1 mL/kg体质量,对照组大鼠给予等体积玉米油灌胃; 隔曰灌胃1次,共染毒14次。实验期间观察大鼠活 动、饮水饮食等情况。染毒结束时,3组大鼠共摄入相 当于0. 411、0.822、1.645倍半数致死量的1,2-DCE。 于末次染毒24 h后进行行为学测试。

1.4行为学测试

1.4.1旷场实验实验在4个涂黑敞箱内进行,敞箱 底面等分成25个正方形。实验在相对安静的环境下 开始。将大鼠轻轻放入箱体中央,采集5 min内大鼠 在箱内的活动情况。中央和外周区域活动时间及路 程由Flyde-maze旷场试验视频分析系统记录,直立次 数由未知实验方案的研究人员记录。

1.4.2糖水偏爱实验实验前进行大鼠糖水适应性 训练:首先每笼放置2瓶糖水(质量分数为1.00%), 1 d后改为1瓶糖水和1瓶纯水,连续放置24 h大鼠 经适应性训练后,禁食禁水1 d,开始糖水偏爱实验。 实验开始前称量1瓶糖水和1瓶纯水的质量后将其放 入笼内由大鼠随意饮用;24 h,分别称量糖水和纯水的剩余质量,计算消耗量,以分析大鼠的糖水偏爱度。 糖水偏爱度=糖水消耗量/总液体消耗量X100. 00%。 1.4.3强迫游泳实验适应性训练:实验前1 d,将 约23 °C的水注入强迫游泳实验装置内,高度>30 cm; 将大鼠放入装置,使其漂浮于水上,并使其下肢无法 触及装置底部以支撑其身体;当大鼠适应水温和水环 境后,使其自由游泳6 min24 h后,在相同的实验条 件下,进行正式实验观察时间为6 min,观察期内大 鼠在桶内自由游泳。由未知实验方案的研究人员记 录大鼠2 ~6 min内的不动时间。以大鼠停止任何挣 扎,漂浮于水面不动或仅做一些支持漂浮在水面的轻 微肢体活动定义为不动状态。

1。5脑组织样品采集及处理于行为学测试结束 后,将大鼠放入麻醉装置中给予异氟烷吸入,麻醉后 经腹主动脉采血,放血法处死。迅速取出全脑,于冰 上分离前额皮层、海马和纹状体等,置于冻存管,以液 氮迅速冷却后,于-80 °C冰箱保存。检测时,从冰箱 中取出冻存的组织样品,称质量后置于匀浆器中,按 1 g :5 mL比例加入预先冷冻4 C的蛋白沉淀液体,冰 浴下快速匀浆2 min。匀浆液于4 C、4 000 xg离心 30 min,取上清液用0。22 pm滤膜过滤后,待测。

1.6脑组织中单胺类神经递质水平检测参照文献 9],采用高效液相色谱-电化学检测法测定1.5制 备的大鼠海马、前额皮层和纹状体样品中5~HTNA和 多巴胺水平。色谱条件:流速1。0 mL/min;进样体积 20 pL;流动相组成A相(磷酸二氢钠缓冲溶液B(乙腈=90 : 10 (V/V);柱温35 C ;检测电势: Et = -150 V,E2 =220 V。该方法的 5-HT、NA 和多巴 胺水平检出限分别为1。 1、1. 0、1。 1 pg/L,加标回收 率分别为 88。 60% ~ 94. 60%、93. 50% ~ 95. 10%、 89。 90% ~95。50%。

1. 7统计学分析采用SPSS 23. 0软件进行统计分 析。计量资料经正态性检验符合正态分布,以x ± s描 述;多组组间均数比较采用单因素方差分析,组间均 数两两比较方差齐时采用SNK检验,方差不齐时采用 Dennett T3法。采用兀线性回归分析1,2—)CE染 毒剂量与单胺神经递质水平的剂量-效应关系;检验

水准a =0。05 (双侧

2结果

2。1基本情况对照组和低剂量组大鼠毛发光泽、 精神状态、活动、饮水和摄食均正常;中剂量组和高剂 量大鼠分别于染毒第9天和第5天后可观察到活动和 精神状态异常持续至染毒结束,表现为精神萎靡、俯 卧、活动减少、弓背。染毒周期内各组大鼠均无死亡。 2.2行为学实验结果与对照组比较,中、高剂量组 大鼠直立次数、中心区域活动时间及路程均减少,糖 水偏爱度下降,游泳中的不动时间延长,差异均有统 计学意义(P <0.05)。见表1。

2。3 1,2—)CE暴露对大鼠不同脑区中单胺类神经递

质水平的影响4组大鼠前额皮层、海马和纹状体中 5~HTNA和多巴胺水平分别比较,差异均有统计学意 义(P <0。01)。两两比较结果见表2。可见,高剂量 组大鼠3种脑区组织中5~HTNA和多巴胺水平均低 于对照组,差异均有统计学意义(P <0。05)。分别以 前额皮层、海马和纹状体的3种单胺神经递质水平 (y)1,2~DCE染毒剂量x)进行一元线性回归分析, 结果显示回归方程均成立P< 0.01)。随着

  • )CE染毒剂量的增加,前额皮层、海马、纹状体中 5~HTNA和多巴胺水平均下降,均呈剂量-效应关 系。 见表 3。

1 4组大鼠行为学指标比较结果 x±s)

组别

动物数

直立次数

中心区域活动

中心区域活动

总路程

糖水偏爱度

不动时间

(只)

(次)

时间s)

路程mm)

(mm)

(%)

C s)

对照组

10

25.5±5.7

21。8±6。5

175.5±24.0

1 838.9 ±299.4

71. 00 ± 8. 60

50.1 ?1.8

低剂量组

10

24.6±4.0

20。0 ±4。5

180。3 ?7。5

1 897。2 ?68。3

68.50 ?.80

55。8 ?0。4

中剂量组

10

19.5?.1ab

15.0?.8ab

147.7?4.2ab

1 703.7 ?09.8

59.50?0.50a

64.0?.8a

高剂量组

10

17。4?。0ab

13。9?。7ab

140.7?6.4ab

1 616。2 ?46。4

59.30?1.30a

61。6?。9a

F

 

6.81

7。16

4。95

2。 04

4。 26

4。 36

P

 

<0.01

<0。01

<0。01

0. 12

0. 01

0. 01

注:与对照组比较,P <0.05;与低剂量组比较,bP <0. 05

 

 

2 4组大鼠前额皮层海马纹状体中5~HTNA和多巴胺水平比较X御,ng/g)

组别

动物数

 

5-HT

 

 

NA

 

 

多巴胺

 

(只)

前额皮层

海马

纹状体

前额皮层

海马

纹状体

前额皮层

海马

纹状体

对照组

10

281.3±29.0

176.1 ?3.1

499.8?2.6

190.6±52.6

328。6 ?2。0

166。9?3。9

270。1 ?3。6

138.3?7.7

4738。2?25。5

低剂量组

10

266.2 ±32.8

159.1 ?6.9

471.2?3.4

179.3 ?2.2

323。0?1。4

161.9?6.5

256.3 ?0.8

121。9?9。2

4516.2?11.0

中剂量组

10

251.0±47.6

138。5?8。4a

335.9?5.6ab

122。6?4。8ab

253.0 ?7.4ab

109。7?0。5ab

249.6?2.1

112.1?1.5a

3 957。4?95。4a

高剂量组

10

194.1?1.9abc

102.4?6.5abc

328。4?9。4ab

119.8?3.7ab

239.8 ?3.0ab

97.4?7.9ab

172.2?1.2abc

74.9?0.0abc

3 182。4?505。7abc

F

 

9.78

14。57

19.98

6。37

4. 86

5. 48

10。16

18。71

10。86

P

 

<0。01

<0。01

<0.01

<0. 01

<0。 01

<0。01

<0.01

<0。01

<0.01

注:与对照组比较,aP<0.05;与低剂量组比较,bP<0。05;与中剂量组比较,cP<0。05

 

 

3 1,24)CE染毒与前额皮层、海马、纹状体5~HTNA和多巴胺水平的剂量-效应关系分析结果

单胺神经递质

 

回归方程

决定系数

F

a

t

P2

5-HT

前额皮层

y =

-1.10 x

+286.67

0。 44

29.44

<0.01

30. 87

<0.01

海马

y =

-0.93 x

:+ 176。55

0. 55

46。06

<0。01

28.14

<0.01

纹状体

y =

-2.32 x

:+489。88

0. 49

36. 42

<0.01

27.86

<0。01

NA

前额皮层

y =

-0.96 x

+186.65

0. 27

14。 08

<0。01

15.94

<0.01

海马

y =

-1。23 x

+ 329。 02

0. 24

11.79

<0。01

20.10

<0。01

纹状体

y =

-0.95 x

+ 167. 38

0。 26

13. 58

<0.01

14.11

<0.01

多巴胺

前额皮层

y =

-1.23 x

+ 280。 08

0. 42

27。08

<0.01

25.88

<0.01

海马

y =

-0.78 x

+139。18

0. 60

57。 60

<0.01

29。47

<0。01

纹状体

y =

-20。17

x +4 804.44

0. 47

33.53

<0.01

30. 10

<0.01

:FPi值和tP2值分别为回归方程检验和回归系数检验的结果

3讨论

机体受到环境中病毒、细菌和有毒有害化学物质 等因素影响后,在出现病理改变和临床症状前通常会 出现行为功能障碍或其他指标异常;特定行为学的改 变能够准确反映中枢神经系统的生理或病理状态,可 作为神经毒性的前期指标M1,24)CE急性或亚急 性中毒主要临床表现为中毒性脑病,脑水肿为主要病 理基础tt1-121,24)CE中毒患者可出现头晕、情感淡 漠、谵妄、抽搐、记忆力下降、反应迟钝、计算力下降等 临床症状M ;患者病情迁延,易反复或突然恶化,后遗 症发生率及死亡率高对生命和健康影响极大。因 此,研究1,24)CE对神经行为的影响对阐明其神经毒 性具有重要意义。

本课题组前期的Morris水迷宫实验结果显示,以 剂量为100和350 mg/m31,24)CE静式吸入连续染 毒28 d,可引起小鼠空间学习和记忆能力下降,且随 着染毒剂量增加和时间延长,其毒性效应增强M。杨 光谦等15的研究以剂量为1 200 mg/m31,2-)CE 静式吸入染毒3 d,结果导致小鼠出现脑损伤,行为学 表现为抱爪现象。旷场实验主要用于评价实验动物 在新异环境(即开阔环境中的自主行为、探究行为与 紧张度16。糖水偏爱实验可反映大鼠欣快感E7]。强 迫游泳实验也被称为绝望实验,是经典的抑郁类行为 学实验,主要测量动物的活跃性;其中的漂浮行为被 用作分析“绝望”的参数,因此也被认为是类似抑郁的 行为M。本课题组前期以剂量为79 mg/kg体质量的

  • )CE隔日灌胃染毒大鼠4周(与本研究的1,24)CE 染毒剂量与染毒时间相近),结果显示,大鼠出现易激 惹、弓背、活动减少、精神萎靡等活动异常°8 ;与本研 究观察到的中、高剂量组大鼠行为学改变_致。但该 研究观察到,大鼠的大脑、小脑皮质与白质组织病理学 检查均未见明显结构性异常,亦未见出血、水肿与坏 死8 ;提示在该研究设计的1,24)CE染毒条件下,尚未 导致大鼠脑组织出现明显的脑水肿病理改变。在此基 础上,本研究结果显示,与对照组比较,中、高剂量组大 鼠直立次数、中心区域活动时间和路程均减少(P < 0。 05),糖水偏爱度下降(P <0。 05),强迫游泳实验中不 动时间延长P<0.05);提示1,2-)CE亚急性染毒可 导致大鼠的自发活动能力和探索能力降低,快感缺 失,求生yu望下降,出现类似抑郁症状。

职业性有机溶剂接触可对职业工人的心理健康 状况产生不同程度的损害。有研究结果显示,苯系物 职业接触可引起女性工人在人际关系敏感、抑郁、焦 虑、敌对4个因子评分上明显上升E9];正已烷接触工 人消极情绪(紧张-焦虑、抑郁-沮丧、愤怒-敌意、 疲惫-惰性、困惑-迷茫)得分升高,而心算平均准确 数、心算能力平均指数、听数字广度平均准确数、听数 字广度能力指数、曲线吻合平均准确数、曲线吻合平 均能力指数、目标追踪平均准确数均下降M ; 1,24)CE中毒性脑病患者的焦虑和抑郁评分值明显升 高M ;但机制尚不清楚。抑郁症病因复杂,且受多种 环境、生理和心理性因素影响°22。目前抑郁症病因机 制主要研究包括:炎症假说、氧化应激假说、神经营养 假说和神经递质假说等^-25 ;其中以单胺神经递质 假说最为久远成熟,该机制认为脑内单胺类神经递质 如5~HTNA多巴胺等的缺乏或代谢异常是导致抑郁 症的最主要因素^6-28。抑郁症患者脑的结构和功能 改变主要存在于前额皮层、海马和纹状体等29];而精 神活动的异常与中枢神经系统突触内的单胺类递质 5~HTNA和多巴胺代谢水平失衡密切相关°9。本研 究发现,随着1,2~DCE染毒剂量增加,大鼠纹状体、海 马和前额皮层中5~HTNA和多巴胺均呈下降趋势 (P<0.05);其中,高剂量组大鼠3个脑区中5~HT、NA 和多巴胺水平均低于对照组(P < 0。 05);提示

  • )CE诱导大鼠抑郁样行为可能与单胺类神经递质 水平的下降密切相关。

综上所述,1,2—)CE亚急性暴露可诱导大鼠出现 抑郁样行为,其机制可能与降低前额皮层、海马和纹 状体内单胺类神经递质的水平变化有关。但该机制 研究只是对神经递质改变的初步探讨,具体哪些相关 信号通路(蛋白和RNA)参与了该过程尚需进一步深 入研究。

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