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Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力
点击次数:348 发布时间:2019-08-12

补肾填髓方对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆
能力及线粒体氧化应激的影响

 

目的观察补肾填髓方对阿尔茨海默病Alzheimers disease, AD)模型大鼠学习记忆能力及线粒体氧化应激的影响方法50只大鼠先用Y迷宫初筛,再按旷场实验得分随机分成正常组模型组假手术组中药组西药组。假手术组两侧侧脑室注 射P淀粉样蛋白AP)424,佘下除正常组外均以双侧侧脑室注射(AP)1^复制AD模型。造模后中药组灌服补肾填髓方西药组灌服 多奈哌齐其他组灌服等容量生理盐水连续干预28 d。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠 脑皮质及血清超氧化物歧化酶superoxide dismufase, SOD)活性硫代巴比妥酸法(TBA)检测大鼠脑皮质及血清丙二醛(malondi- aldehyde, MDA)活性透射电镜观测海马线粒体超微结构结果与模型组比较中药组和西药组大鼠水迷宫逃避潜伏期缩短,在原 平台象限游泳时间及距离的百分比增加差异均有显著统计学意义(P<0.05P<0。01)。与模型组比较中药组SOD活性升高,MAD 活性减低(P<0.05P<0.01);西药组的SOD活性升高MDA活性降低(P<0.01);中药组及西药组的海马线粒体超微结构病理损害改 善结论补肾填髓方可以改善AD大鼠的学习记忆能力其机制可能与改善线粒体氧化应激有关

关键词阿尔茨海默病补肾填髓方氧化应激线粒体

 

阿尔茨海默病Alzheimers disease, AD)是与 年龄相关的中枢神经系统退行性疾病,以进行性记 忆下降及认知损伤为特点[1]由于人口老龄化,目前 世界范围内AD患病人数已经达到4 400[2]给社 会带来沉重负担AD的病因和发病机制复杂且并 不完全清楚,现在的治疗药物不能完全满足临床需 要,并且费用昂贵还存在肝毒性腹泻恶心呕吐头晕等不良反应[3]因此研究疗效更确切副作用 更少的AD治疗药物非常紧迫近年来大量文献研 究报道AD与氧化应激联系紧密,改善氧化应激可 以明显改善AD[4-6]补肾填髓方是根据中医学理论 肾虚髓亏”,基于经典方剂孔圣枕中丹(《千金方化裁而成相关研究证实补肾填髓方药能有效延缓 痴呆早期患者大脑结构的萎缩,改善其认知及记忆 功能'但其作用机制并不十分明确本研究拟以 AD模型大鼠为实验对象从线粒体的氧化应激角 度探讨补肾填髓方抗AD的作用机制

1材料与仪器

1.1实验动物

90只健康雄性清洁级SD大鼠体质量(180±20)g, 购自斯莱克景达实验动物河北11选5,许可证号:SYXK (2010-0013;实验动物来源证号430047000饲 养于湖南省人民医院动物实验室所有动物饲养在 室温22~25湿度40%~60%条件下,以普通饲料 喂养自由进食饮水将大鼠观察性饲养1周后进行 Y迷宫实验初筛。

1.2实验药物试剂及仪器设备

补肾填髓方由石菖蒲10 g,远志10 g何首乌 15 g,yin羊藿15 g,龟板20 g龙骨20 g组成。盐酸 多奈哌齐片,卫材药业河北11选5批号1611013。 ApW2,Sigma 公司,批号A4559A^42-1,Sigma 公司,

批号:A2201(以无菌双蒸水将ApM2AP42-1配制成 浓度为2 pg/pL,置于37 t恒温箱孵育7 d保存于 4 °C 冰箱备用)。丙二醒(malondialdehyde,MDA)试剂 盒南京建成,批号A003-1。超氧化物歧化酶(su-peroxide dismufase, SOD)试剂盒 武 汉华美 批号 P03037347大鼠脑立体定位仪,美国K0PF(Model- 900)。Morris水迷宫上海欣软(XR-XM101)。Y迷宫, 上海软隆(BW-MYM103)。透射式电子显微镜,美国 FEI 公司(Tecnai G2 Spirit)。

2方法

2.1 AD大鼠模型的复制及干预

根据参考文献[8]Y型迷宫初筛,剔除先天愚 钝的大鼠随后依据旷场实验水平运动得分将大鼠 分为正常组假手术组模型组西药组中药组每 组10只参照Xi[9]方法复制AD模型除正常组 夕卜,各组大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg)腹腔注射 麻醉后俯卧固定于脑立体定位仪常规备皮消毒头 顶正中切开皮肤找到大鼠前囟,结合大鼠脑立体 定向仪图谱[10]及预实验结果,在大鼠两侧侧脑室(位 置前囟后1 mm矢状缝向左右侧劳开1。5 mm4.6 mm)用针头钻开颅骨,假手术组两侧侧脑室 注入AP42-1 5 pL其余实验组缓慢注入ApM2 5 pL注入时间均为5 min留针时间5 min,注射完毕后 缝合皮肤,局部红霉素外涂防感染

正常组不灌胃其他组造模后隔天开始灌胃。根 据人与大鼠换算系数0.018,以大鼠体质量200 g成 人体质量60 kg为参考西药组按0。33 mg/(kgd)、中 药组按生药量8.1 g/(kg,d)的剂量灌胃,给予药液 8 mL/(kgd)。模型组和假手术组灌服等容量生理盐 水连续给药4

造模成功标准[8]:造模结束后第15,对大鼠再次进行Y型迷宫筛选15次测试中正确次数 比造模前下降1/3者为造模成功。共剔除死亡大鼠 5造模失败3将存活的成功模型纳人下一步 实验其中假手术组8模型组7中药组9, 西药组8正常组10成模率80%并遵循随 机原则补齐每组动物为10

  • Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力

在各组大鼠28 d干预完成后,每天下午14:30 左右开始定位航行训练连续5 d。每天将大鼠面向 池壁分别从4个平均分布的标记点轻轻放人水中, 记录1 min内其找到水下平台所花费的时间逃 避潜伏期escape latency)。6天移除隐藏的平 台,从定位航行实验的第1个人水点将大鼠放人水 池记录1 min内大鼠经过虚拟平台的总次数原平 台象限的活动时间与距离占总游泳时间及总游程 的百分比[11]。

  • ELISATBA法分别测定前额皮质组织匀浆及血 清中SODMDA活性

水迷宫测试结束后大鼠用10%水合氯醛 (350 mg/kg)麻醉腹主动脉采血后,断头取脑碎冰上 迅速分离出大鼠前额皮质预冷的生理盐水洗净血zi, 吸干水分后称质量,制备成10%组织匀浆液分别低 温离心机3 500 r/min离心匀浆液及血液15 min取 上清按照SODMDA试剂盒说明书操作测定。

2.4电镜观察

大鼠麻醉处死后断头取脑,碎冰上分离大鼠海 马,2.5%戊二醛固定2 h以上0。1 mmol/L磷酸 缓冲液清洗31%锇酸固定1~2 h,0.1 mmol/L 磷酸缓冲液漂洗3常规50%70%90%100% 丙酮脱水经过浸泡包埋固化后超薄切片机切片, 柠檬酸铅和醋酸铀双染,透射电镜下放大20 000

观察并拍照记录

2.5统计方法

SPSS l7。0软件进行统计分析实验数据均 用x±s表示水迷宫逃避潜伏期采用重复测量方差 分析[12],其余各组间比较使用单因素方差分析组间 两两比较使用LSD检验P<0。05表示差异有统计学 意义

3结果

3。1 水迷宫定位航行试验

随着训练时间的延长各组大鼠逃避潜伏期逐 渐缩短与假手术组比较,模型组第3天开始出现逃 避潜伏期延长P<0.01);与模型组比较,中药组西 药组逃避潜伏期第3天开始缩短(P<0.01 )。与西药组 相比中药组逃避潜伏期稍有延长但差异无统计学 意义(P>0.05)。见图11

3.2水迷宫空间探索试验

与假手术组相比模型组大鼠原平台象限游泳时 间百分比及游泳距离百分降低,差异有统计学意义 P<0。01);与模型组相比中药组西药组游泳时间

及游泳距离的百分比升高(P<0.05P<0.01);与西 药组相比,中药组原平台象限游泳时间所占百分比 稍有降低但两者差异无统计学意义(P>0.05),中药 组原平台象限游泳距离所占百分比降低,两者差异 有统计学意义(P<0.01)。见表22

2补肾填髓汤对AD大鼠在原平台象限游泳时间、

组别

游泳时间百分比

游泳距离百分比

正常组

59.06±10.39

29.22±6.46

假手术组

56.36± 11.40

27。99±4。22

模型组

28.61±9.86**

16.07±3.39**

西药组

48.68±12.89##

23.53±4.34##

中药组

44.27±9.95*##

21。97±5。13**#“

F

12.10

25.10

P

0.000

0.000

距离百分比的影响X±s,n=10,%)

 

与假手术组比较<0.05*<0。01;与模型组比较,#<0。05, ##P<0。01;与西药组比较,▲▲P<0.01

2各组大鼠空间探索轨迹图

3.3补肾填髓方对大鼠前额皮质组织及血清SODMDA酶活性的影响

与假手术组比较,模型组SOD活性明显下降,MDA 活性显著升高(P<0.01);与模型组比较中药组西 药组SOD活性均升高MDA活性均显著下降(P<0.05P<0。01);西药组与中药组SOD活性MDA活性比 较差异无统计学意义(P>0。05)。见表3。

3.4补肾填髓方对大鼠海马线粒体的影响

电镜结果显示正常组和假手术组线粒体形态 清楚完整大小形状规则,分布均匀且数目多,外膜 平整光滑线粒体膜间隙无明显扩张,线粒体嵴排列 整齐呈板层状内膜和嵴内腔含有较多均匀的颗粒 状基质未见线粒体水肿及空泡化改变。

模型组部分线粒体形态欠完整结构不清晰体 积缩小大小形状不规则分布紊乱且数目减少线 粒体外膜模糊内嵴大量断裂或溶解消失,线粒体肿 胀基质疏松清淡未见基质颗粒出现空泡化改变中药组西药组大鼠线粒体组织结构上较为完整清 晰,大小形状相对规则数目较模型组增多,外膜可 见尚光滑,内嵴增多排列比较整齐偶可见嵴内腔 稍有扩大内嵴溶解减轻部分线粒体肿胀明显改 善基质较均匀,可见少许基质颗粒见图3

3各组大鼠海马线粒体电镜观察图X20000)

4讨论

 
  

AD是一种与年龄相关的神经系统退行性疾 病,P淀粉样蛋白沉积成老年斑是AD病理标志,并 且被认为直接损害学习能力和记忆[13],其中Ap^

 

够自我组装形成寡聚体和淀粉样纤维而具有很强的 细胞毒性;A Pw作为它的反序列肽缺乏了自我组 装及构成毒性寡聚态的能力不具有细胞毒性故而 在许多研究中作为APi-2的对照肽[14]。条件恐惧放 射状迷宫Morris水迷宫实验Y迷宫实验等均是 AD行为学评价的常用方法[15-16]AD患者后期多伴 有如幻想焦虑抑郁等精神症状旷场实验是评价 实验动物在新异环境中自主行为探究行为与紧张 度的一种方法常用于评价实验动物在新异环境中的 焦虑状态初期就选择Y迷宫进行初筛,并配合旷 场实验评分既可避免Morris水迷宫初筛大鼠会遗 留对平台记忆干扰后期Morris水迷宫测试结果又 可排除大鼠情绪原因引起自主活动差异而影响最终 的测试结果造模后大鼠Morris水迷宫实验测定结 果显示,模型组逃避潜伏期延长在原平台象限的游 泳时间和游泳距离百分比缩短假手术组未见明显 变化,表明模型大鼠学习记忆受损

AD发病机制复杂多种因素参与了它的发病过 程其中氧化应激可能在其中占有重要的地位大量 实验研究及回顾性研究均提出AD发生发展与氧化 应激密切相关[17-19]尽管生理浓度的活性氧在体内 的一些信号通路中起着重要作用但活性氧的过度 产生会引起脂质蛋白核酸等分子损伤MDA是一 种重要的脂质过氧化产物表明了机体受氧化损伤的程 度活性氧的消除主要通过酶促及非酶促两种途径SOD是体内重要抗氧化酶,可通过催化还原态单电 子氧转化为过氧化氢从而清除体内氧自由基减轻 氧化损伤的程度维持生物体细胞成分正常的结构 和功能[20]通过抗氧化手段进行干预或可延缓疾病 向AD终末的进展本实验结果显示模型组血清及 皮质抗氧化酶SOD活性均有下降MDA活性均表 现升高趋势中药组可以升高皮质及血清中的SOD 活性,降低MDA活性表明补肾填髓方可以增强机 体的抗氧化能力拮抗过度产生的氧自由基这与姜 招峰等™的研究有共通之处其研究表明海马及皮 层部位的氧自由基损伤与大鼠记忆及学习能力密切 相 关

由于线粒体电子传递中不可避免的出现电子泄 露成为了机体活性氧主要产生来源90%内源性氧自 由基均由线粒体而来线粒体自身亦可受到氧自由基的 破坏加剧线粒体的损伤从而形成恶性循环[22]。本 研究通过电镜观察线粒体超微结构结果显示模型 组线粒体形态不完整结构破坏体积变小分布紊 乱且数目减少出现空泡化改变表明AD模型鼠线 粒体整体结构受损大鼠灌服中药补肾填髓方能使 线粒体组织结构部分恢复大小形状变得规则数 目增多表明补肾填髓方对受损的AD大鼠线粒体 结构的破坏有改善作用

AD属于中医学痴呆”“呆证的范畴,病性以 本虚标实为主以髓海空虚为本,痰浊瘀血阻络为 标,而肾虚髓空是其根本原因肾与脑之间有着密不 可分的联系,“痴呆的中医药治疗多集中在补肾填 髓。老年痴呆临床辨证分型流行病调查也发现髓海 不足证在所有证型中出现频次zui高[23]。补肾填髓方 基于经典方剂孔圣枕中丹”(千金方》)化裁而成以yin羊藿何首乌为君药功效在于滋阴补肾强精 益血臣药龟板龙骨强精益髓增慧添智佐以远 志石菖蒲开窍豁痰,醒神益智纵观全方药物组成, 主要功效在于补肾填髓且兼顾了化痰开窍。现代药 理研究表明yin羊藿中的成分yin羊藿苷可以通过抗 氧化应激、抗炎清除自由基抑制乙酰胆碱酯酶的 活性以及抑制AP聚集等途径发挥对AD的改善作 [24]。何首乌主要水溶性成分二苯乙烯苷可改善拟 痴呆大鼠的学习记忆能力提高大鼠海马组织CA1 区脑啡肽酶及低密度脂蛋白相关受体1表达,增强 对AP的降解和转运[25]。远志粗提物经D101大孔吸 附树脂富集后,发现皂苷类成分和黄酮类成分或许能 通过抗氧化应激,改善小鼠的学习记忆功能m。石菖蒲 的主要有效成分P-细辛醚可以改善认知功能其作用 机制包括了抑制炎症因子IL-ipTNF-a的分泌及下 调AQP4的表达来保护星形胶质细胞[27]

本实验显示补肾填髓方可以改善AD大鼠的学习 记忆能力增强抗氧化应激能力且能够改善线粒体的 结构其机制可能与改善线粒体相关的氧化应激有 关更深人的机制研究还需下一步进行

 

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