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转棒实验检测小鼠抗疲劳能 力
点击次数:70 发布时间:2019-08-26

摘要:【目的】比较雌、雄海马对小鼠抗疲劳和改善记忆障碍的不同作用。【方法】转棒实验检测小鼠抗疲劳能 力,将小鼠分3组,1组喂食普通饲料,另外2组分别喂食含有质量分数0.22%雌、雄海马的饲料,共喂食6周。 跳台实验检测小鼠记忆能力将小鼠为4组正常组与乙醇组喂食普通饲料,另外2组分别喂食含有质量分数0.22% 雌、雄海马的饲料,共喂食6周。体积分数30%乙醇灌胃乙醇组和雌、雄海马组诱导小鼠记忆损伤模型结果】 抗疲劳实验中,与对照组相比,喂食雄海马的小鼠在棒时间显著延长(尸<0.05),其血清中乳酸含量显著降低P <0.05);而喂食雌海马的小鼠在棒时间和血清乳酸含量均无明显改变。乙醇记忆损伤实验中,与对照组相比,模 型组小鼠跳下平台的潜伏期显著下降(尸<0.01),错误数(次)显著升高(尸<0.01);与模型组相比,喂食雄海 马的小鼠跳下平台的潜伏期显著升高(尸<0.05),错误数(次)显著减少(尸<0.05),脑组织中的乙酰胆碱酯酶 活性显著降低(尸<0.05);而喂食雌海马的小鼠上述指标均无改变。结论】在增强小鼠抗疲劳能力和改善记忆方 面,雄海马的功效显著而雌海马无效。

关键词:雌、雄海马;抗疲劳;gai善记忆

 

随着现代生活节奏的加快,疲劳的产生对人们 生活质量产生了越来越大的影响。延缓疲劳发生, 迅速消除疲劳,对人们身体健康极为重要[1]。学习 记忆是大脑重要功能之一,也是人类赖以生存和进 化的关键。由外力、环境污染以及酒精等引起的记 忆损伤,特别是因酒精引起的记忆损害越来越多, 会严重危及人类的正常生活工作,造成严重经济负 担。由于海洋的独特环境,许多海洋药物具有高效 的活性和特殊的药理作用机制,在抗疲劳和记忆改 善方面的作用日益受到人们的重视[2]。

海马入药历史悠久,药理作用广泛,除性激素 样作用[3-4]外,还具有抗炎[5]、抗氧化、抗疲劳和抗 癌[6]、抗抑郁[7]等作用。三斑海马能显著延长小鼠 负重游泳时间,减少运动过后的乳酸生成并加速乳 酸代谢,其抗疲劳效果优于人参[8]。“深海龙”是一 种含有海马有效成分的水丸,服用后能显著提高人 体无氧功率、定量负荷以及极限负荷工作能力[9]。 药理研究发现海马水、醇提取物能在一定程度上改 善记忆[10]。小鼠妊娠晚期,一次性灌胃谷氨酸单钠, 可明显降低60日龄仔鼠Y迷宫学习记忆能力[11]。 从三斑海马中分离出的一种肽类初制剂,可拮抗谷 氨酸单钠的上述作用[12]。三斑海马中分离出的一种 小分子多肽能抵抗Ap诱导的神经毒性,有望治疗 老年痴呆[13]。此外,海马富含DHAEPA-3多不 饱和脂肪酸对大脑有很好保护作用的成分[14]

目前对《中国药典》2015版收录的5种高药用 价值海马的研究,主要是三斑海马,但三斑海马养 殖较为困难,难以满足市场需求。而线纹海马因抗 病能力强、存活率高、生长速率快优点[15],成为近 年来的养殖shou选。同时线纹海马较三斑海马异亮氨 酸、亮氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸含量高,这些成 分对维护机体健康,增强免疫力有重要作用[16]。目 前关于线纹海马的研究主要集中在抗炎[17]方面,且 传统中药习惯将线纹海马雌雄配对入药[18],单雄性 或单雌性海马功效研究尚未见报道。本研究以单雌 性和单雄性海马饲喂小鼠,利用转棒实验和急性乙 醇记忆损伤模型,分析雌、雄海马对小鼠增强疲劳 耐受和改善记忆的功效,并通过测定血清中乳酸 (LA)含量反映小鼠疲劳程度,脑组织中乙酰胆碱 酯酶AChE)以及乙酰胆碱转移酶ChAT)活性 反映小鼠与学习记忆有关的胆碱能系统变化,以期 进一步阐明线纹海马功效的机制,为线纹海马保健 品和药品开发研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料

无特定病原体SPF级)六周龄雄性昆明种小 鼠,体质量22〜24 g购自济南朋悦实验动物繁育 河北11选5(合格证号:37⑻92⑻008874 )。小鼠饲 养于SPF级动物房,温度(23±1 )C,湿度(50±10 )%, 12 h光照(7: 00—19:⑻),自由饮食和摄水。小 鼠适应环境7d后开始实验,此时小鼠体质量均值 为33 g线纹雌海马、线纹雄海马,由深圳市万骐 海洋生物科技河北11选5提供。YLS-4C转棒式疲劳 仪,济南益延科技发展河北11选5;XR-3TB跳台实 验系统,上海欣软信息科技河北11选5;高速冷冻台 式离心机,Beckman公司;RT-61⑻酶标仪,Rayto

公司。无水乙醇,成都市科龙化工试剂厂。ELISA 试剂盒LAAChEChAT产品批号分别为 20170705536T、 20170711258T、 20170702163T

江苏雨桐生物科技河北11选5提供。海马饲料由海马 粉末与普通粉末饲料按比例混合均勻,混合后的饲 料4C下储存,小鼠食用饲料每天更新,避免海马 氧化。

 

1.2万法

1。2。1实验分组海马抗疲劳实验共分3(《 = 15):对照组饲喂普通饲料,雌海马组饲喂质量分 数0.22%的雌海马饲料,雄海马组饲喂质量分数 0.22°%的雄海马饲料。海马记忆改善实验共分4组 (« = 15):对照组以及乙醇组饲喂普通饲料,雌海 马组饲喂质量分数0.22%的雌海马饲料,雄海马组 饲喂质量分数0.22%的雄海马饲料。海马粉末不溶 于水,故采取拌饲料喂食的方式,该方法成熟,应 用广泛[19]。两个实验均喂食海马饲料6周,记录初 始体重,之后每周末称重一次。

1.2.2小鼠转棒实验[20]先进行为期3d的适应性 预实验,每天将小鼠放置在转棒疲劳仪上,设置转 棒疲劳仪转速20 r/min时间10 min如有小鼠中 途掉落,则将小鼠放回转棒上继续适应。正式实验 中,设定转速40 r/min记录5 min内小鼠从开始 到掉棒的时间。本实验为一次性测试结果。

1。2。3跳台实验[21]体积分数30%的乙醇以10 mL/kg的剂量在实验前1 h灌胃乙醇组和雌、雄海 马组,造成急性乙醇中毒所致记忆损伤造模。跳台 实验时,将小鼠放置在平台上,自由探索试验箱3 min,后将小鼠放置在箱内铜栅上,铜栅通电(30 mA 恒流)以刺激小鼠找到平台。24 h后正式测试,记 录5 mm内小鼠第一次跳下平台的时间,即潜伏期, 以及5 mm内小鼠跳下平台的总数(次),即错误数 (次)。本实验为一次性测试结果。

1.2.4样品采集转棒实验结束30 min后,小鼠断 头颈部取血全血静置0。5 h,以转速3⑻0 r/min心10 min保存血清于-80 °C冰箱。跳台实验结束 24 h后,小鼠断头,迅速将全脑剥离,液氮冷冻后 保存于-80 C冰箱。

1.2.5生化指标测定根据ELISA试剂盒说明书, 测定抗疲劳实验小鼠血清LA含量,记忆障碍实验 小鼠全脑AChEChAT活性。

1.2.6数据处理所有数据均用均值±标准误差 (Y盨E)表示,SPSS 19 统计分析,Graphpad 

1。2万法

1。2。1实验分组海马抗疲劳实验共分3(《 = 15):对照组饲喂普通饲料,雌海马组饲喂质量分 数0.22%的雌海马饲料,雄海马组饲喂质量分数 0.22°%的雄海马饲料。海马记忆改善实验共分4组 (« = 15):对照组以及乙醇组饲喂普通饲料,雌海 马组饲喂质量分数0。22%的雌海马饲料,雄海马组 饲喂质量分数0。22%的雄海马饲料。海马粉末不溶 于水,故采取拌饲料喂食的方式,该方法成熟,应 用广泛[19]。两个实验均喂食海马饲料6周,记录初 始体重,之后每周末称重一次。

1。2。2小鼠转棒实验[20]先进行为期3d的适应性 预实验,每天将小鼠放置在转棒疲劳仪上,设置转 棒疲劳仪转速20 r/min时间10 min如有小鼠中 途掉落,则将小鼠放回转棒上继续适应。正式实验 中,设定转速40 r/min,记录5 min内小鼠从开始 到掉棒的时间。本实验为一次性测试结果。

1.2.3跳台实验[21]体积分数30%的乙醇以10 mL/kg的剂量在实验前1 h灌胃乙醇组和雌、雄海 马组,造成急性乙醇中毒所致记忆损伤造模。跳台 实验时,将小鼠放置在平台上,自由探索试验箱3 min,后将小鼠放置在箱内铜栅上,铜栅通电(30 mA 恒流)以刺激小鼠找到平台。24 h后正式测试,记 录5 mm内小鼠第一次跳下平台的时间,即潜伏期, 以及5 mm内小鼠跳下平台的总数(次),即错误数 (次)。本实验为一次性测试结果。

1.2.4样品采集转棒实验结束30 min后,小鼠断 头颈部取血,全血静置0.5 h以转速3⑻0 r/min心10 min,保存血清于-80 °C冰箱。跳台实验结束 24 h后,小鼠断头,迅速将全脑剥离,液氮冷冻后 保存于-80 C冰箱。

1。2。5生化指标测定根据ELISA试剂盒说明书, 测定抗疲劳实验小鼠血清LA含量,记忆障碍实验 小鼠全脑AChEChAT活性。

1。2。6数据处理所有数据均用均值±标准误差 (Y盨E)表示,SPSS 19 统计分析,Graphpad 

1.2万法

1.2.1实验分组海马抗疲劳实验共分3(《 = 15):对照组饲喂普通饲料,雌海马组饲喂质量分 数0。22%的雌海马饲料,雄海马组饲喂质量分数 0。22°%的雄海马饲料。海马记忆改善实验共分4组 (« = 15):对照组以及乙醇组饲喂普通饲料,雌海 马组饲喂质量分数0.22%的雌海马饲料,雄海马组 饲喂质量分数0.22%的雄海马饲料。海马粉末不溶 于水,故采取拌饲料喂食的方式,该方法成熟,应 用广泛[19]。两个实验均喂食海马饲料6周,记录初 始体重,之后每周末称重一次。

1。2。2小鼠转棒实验[20]先进行为期3d的适应性 预实验,每天将小鼠放置在转棒疲劳仪上,设置转 棒疲劳仪转速20 r/min时间10 min如有小鼠中 途掉落,则将小鼠放回转棒上继续适应。正式实验 中,设定转速40 r/min记录5 min内小鼠从开始 到掉棒的时间。本实验为一次性测试结果。

1.2.3跳台实验[21]体积分数30%的乙醇以10 mL/kg的剂量在实验前1 h灌胃乙醇组和雌、雄海 马组,造成急性乙醇中毒所致记忆损伤造模。跳台 实验时,将小鼠放置在平台上,自由探索试验箱3 min,后将小鼠放置在箱内铜栅上,铜栅通电(30 mA 恒流)以刺激小鼠找到平台。24 h后正式测试,记 录5 mm内小鼠第一次跳下平台的时间,即潜伏期, 以及5 mm内小鼠跳下平台的总数(次),即错误数 (次)。本实验为一次性测试结果。

1.2.4样品采集转棒实验结束30 min后,小鼠断 头颈部取血全血静置0.5 h,以转速3⑻0 r/min心10 min,保存血清于-80 °C冰箱。跳台实验结束 24 h后,小鼠断头,迅速将全脑剥离,液氮冷冻后 保存于-80 C冰箱。

1.2.5生化指标测定根据ELISA试剂盒说明书, 测定抗疲劳实验小鼠血清LA含量,记忆障碍实验 小鼠全脑AChEChAT活性。

1.2.6数据处理所有数据均用均值±标准误差 (Y盨E)表示,SPSS 19 统计分析,Graphpad 

图。参数数据均采用单因素方差分析,进行LSD检 验,非参数数据(跳台潜伏期和抗疲劳行为实验) 均米用 Kruskal-Wallis 分析,进行 Wilcoxon- Mann-Whitney U-test检验。所有检测指标《 = 15。

2实验结果

 

2.1雌、雄海马对小鼠体质量影响

图1可知,实验前,各组小鼠体质量没有差异 (P>0。05)。饲养6周后,各组小鼠的体质量均有 增加,但与对照组相比,饲喂雌、雄海马的小鼠体 质量均无显著差异(户>0。05),说明雌、雄海马对 小鼠的正常生长并无影响。

 

2.2雌、雄海马饲喂对小鼠抗疲劳耐受时间影响

小鼠从开始到掉棒的持续时间越长,表示小鼠 耐受时间越长,抗疲劳能力越强。图2显示,与对 照组相比,雌海马组的耐受时间无显著差异(户> 0.05 ),雄海马组的耐受时间则显著升高(丑 =7.353, P<0.05 ),说明仅雄海马能增强小鼠抗疲劳能力。

2.3雌、雄海马饲喂对小鼠血清中乳酸LA影响

图3显示,雄海马对血清乳酸水平有显著效果 (F(2,42)=3.465, P<0。05)。与对照组相比,雌海 马组的血清LA水平无显著差异P>0。05 ),雄海 马组的血清LA水平则显著降低P<0.05 );与雌 海马组相比,雄海马组的血清LA水平也显著降低 (P<0。05)结果表明雄海马能有效降低运动疲劳 后小鼠体内LA含量。

2。4雌、雄海马对小鼠跳台潜伏期和错误数(次) 影响

图4显示,雄海马对乙醇诱导的跳台潜伏期有 显著改善效果(万=29.364, P<0.01)。与对照组相 比,乙醇组的潜伏期显著降低P<0.01);与乙醇 组相比,雌海马组的潜伏期无明显升高P>0.05), 雄海马组的潜伏期则显著升高(P<0。01 )表明30% 乙醇灌胃能造成小鼠记忆损伤,雄海马能显著改善 这种记忆障碍,而雌海马无效。

 

4雌、雄海马对小鼠跳台潜伏期的影响 Effect of female and male sea horse on step-down latency in mice

图5显示,海马对乙醇诱导的跳台错误数(次) 有显著改善效果F(3,56)=12.315, P<0.01)。与对 照组相比,乙醇组的错误数(次)显著升高P< 0.01 );与乙醇组相比,雌、雄海马组的错误数(次) 均显著降低P<0.05)。表明对于乙醇造成的记忆 损伤,雌、雄海马能部分进行改善。

  

 

**, VS 对照组 P<0.01; #, VS 乙醇组 P<0。05
**, VS control group P<0.01; #, VS female sea horse group P<0.05

5雌、雄海马对小鼠跳台错误数(次)的影口向
Fig. 5 Effect of female and male sea horse on the number of
errors in step-down test in mice

2.5雄海马对小鼠脑内乙酰胆碱酯酶AChE和 乙酰胆碱转移酶ChAT活性影响

图6显示,海马对乙醇诱导的AChE活性有显 著改善效果F(3,56)=13.5 3 5, P<0。05)。与对照组 相比,乙醇组AChE活性显著升高P<0.01);与 乙醇组相比,雄海马组AChE活性显著降低P< 0.05)。结果表明,乙醇能导致小鼠脑内AChE活性 上升,雄海马能逆转这一影响

6雌、雄海马对小鼠脑内乙酰胆碱酯酶活性的影响
Fig. 6 Effect of female and male sea horse on the brain
activity of AChE in mice

图7显示,与对照组相比,乙醇诱导使得脑内 ChAT 活性显著降低F(3,56) =5.656,尸<0.05);但 是与乙醇组相比,雌、雄海马两个组ChAT活性均 没有变化(尸>0.05)。结果表明,乙醇造成的记忆 损伤会使脑内ChAT活性下降,但是雌、雄海马对 这一变化并无改善作用。

3讨论

运动耐力是反映机体疲劳最直jie客观的指标, 运动耐力的增强是抗疲劳能力增强的最有力表现。 小鼠转棒实验是一种强迫全身消耗性实验,其运动 时间的长短是衡量疲劳的一个指标[22]。乳酸是机体 在无氧条件下进行糖代谢的终产物,剧烈运动时机 体会产生大量乳酸,乳酸的积累会导致机体疲劳, 可反映机体疲劳程度[23]。在本研究中,雄海马表现 出对血乳酸的清除作用,提高了机体对氧的利用能 力,降低了无氧酵解程度,从而延长了小鼠运动耐 受时间。彭汶铎等[24]也发现小鼠连续14 d灌胃海马 酶解提取物,在一次性运动和递增运动量疲劳模型 中,小鼠血清中乳酸含量均显著降低。但是饲喂雌 海马的小鼠,其耐受时间与血清乳酸含量与对照组 相比,并无明显变化,证明单独的雌海马不能改善 小鼠的运动机能,没有抗疲劳作用。

跳台实验是检测动物学习记忆能力的常用方 法,跳台潜伏期和错误数(次)是评价动物学习记 忆的重要指标。潜伏期长,错误数(次)少,表明 动物的学习记忆能力强。本研究中,30°%乙醇灌胃 对小鼠的学习记忆能力造成了损伤。一次性饮人过量乙醇,能引起中枢神经系统由兴奋转为抑制状 态,首先作用于大脑皮层,然后累及皮层下中枢和 小脑,导致记忆力下降[25]。乙醇对中枢神经系统的 损伤机制比较复杂,其中之一是对胆碱能系统的影 响[26]。而中枢胆碱能系统则与学习记忆密相关,胆 碱能系统的重要神经递质乙酰胆碱ACh),其释放 量随着学习与记忆、探究行为等认知活动的发生而 随之改变。ChATACh的合成起着催化作用,而 AChE则参与脑内ACh的分解,使神经递质对突触 后膜的兴奋作用终止,保证神经传递正常。在大脑 内,ChATAChE共同维持着ACh的动态平衡[27]。 由于ACh性质极不稳定,容易水解,故通过检测 ChATAChE的活性间接来反映ACh的含量。从 实验结果可知,乙醇组ChAT活性降低,AChE活 性升高,即ACh分解加快而合成减少,AChE总体 水平降低,学习记忆受损。从行为上看,饲喂雄海 马的小鼠其学习记忆有所改善,潜伏期增加,错误 数(次)减少;而饲喂雌海马的小鼠,学习记忆能 力并未改善。生化指标则显示,饲喂雄海马的小鼠 其脑内AChE活性与乙醇组相比显著降低ChAT 活性则无明显变化,提示雄海马对学习记忆的改善 可能是通过抑制ACh分解而非加速其合成,此外在 不同记忆损伤模型小鼠中,利用不同中药如夏天无 和刺五加,均显示可通过抑制AChE来达到记忆改 善的效果[28-29];由于雌海马未能改善乙醇造成的学 习记忆损伤,所以与乙醇组相比,饲喂雌海马的小 鼠其脑内ChATAChE活性也无改变。

本研究存在以下两点不足:1。评价抗疲劳经典 药效学实验有转棒疲劳和负重游泳,评价记忆改善 的有跳台,避暗及水迷宫实验。目前本实验只各米 用了其中一种方法。2.实验中所用海马为粉末粗材 料,应该找出其中的有效成分进行实验。接下来笔 者及研究团队将对雌、雄海马成分进行更深人的分 析,优化海马提取物,完善实验方案,为更准确、 更好地利用海马资源提供理论依据。

4结论

雄海马可以通过降低体内乳酸含量,增强小鼠 的抗疲劳能力;通过抑制乙酰胆碱酯酶,改善小鼠 的学习记忆能力;而单独的雌海马则没有上述功 能。雄海马在抗疲劳和改善记忆方面的效果显著而 雌海马无效。

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